論文のメモ: 28S rRNAのhidden breakについて

一部の生物種は、28S rRNAの真ん中あたりに切れ目が入っていることをこの記事に書きました。その切れ目はhidden breakと呼ばれ、28S rRNAが分裂するときに一部の塩基が消失することはgap deletionと呼ばれているみたいです。

今回は、hidden breakについて少し文献を読んだので、ここにまとめます。

「ハダカデバネズミは分裂する28S rRNAを持ち、正確なタンパク翻訳をおこなう」

Azpurua J., Ke Z., Chen I.X., Zhang Q., Ermolenko D.N., Zhang Z.D., Gorbunova V., and Seluanov A., 2013, Naked mole-rat has increased translational fidelity compared with the mouse, as well as a unique 28S ribosomal RNA cleavage, PNAS, 110 (43), 17350-17355.

なんとなく、すごく読みやすかった論文。

28S rRNAにhidden breakがあると報告されている生物種は、昆虫や甲殻類が多いみたいですが、ハダカデバネズミにもhidden breakがあるようです。28S rRNAの分裂はリボソームの構造に影響するので、タンパクの合成速度と忠実度（fidelity）も影響を受けるだろうと仮説を立てて、ハダカデバネズミの翻訳速度とfidelityをhidden breakがないマウスのそれと比較しています。

結果、翻訳速度はマウスと同じだったけど、ルシフェラーゼアッセイで測定した翻訳のfidelityはマウスよりも高かったそうな。Hidden breakの存在とfidelityとの関係は直接調べたわけではないのでそのあたりは強引な論文ですが、ハダカデバネズミを用いてる点がPNASに載る所以でしょうか…。

「哺乳類の28S rRNAにおける新規のプロセッシング」

Melen G.J., Pesce C.G., Rossi M.S., and Kornblihtt A.R., 1999, Novel processing in a mammalian nuclear 28S pre‐rRNA: tissue‐specific elimination of an ‘intron’bearing a hidden break site, EMBO J, 18 (11), 3107-3118.

上の論文で引用されてた、哺乳類でも28S rRNAのhidden breakが見つかった例。今のところ哺乳類でhidden breakが見つかったのは、上の論文のハダカデバネズミとこの齧歯類だけみたいです。

面白いのが、睾丸testisのみでhidden breakのない28S rRNAも見つかっている点。他の部位ではイントロン?のところでhidden breakが生じるのに対して、testisではイントロンが除去されてhidden breakが生じない、ということ。そのあたりのメカニズムは良く分かってないみたいです。

「アルテミアとプラナリアの28S rRNAにおけるgap region」

Sun S., Xie H., Sun Y., Song J., and Li Z., 2012, Molecular characterization of gap region in 28S rRNA molecules in brine shrimp Artemia parthenogenetica and planarian Dugesia japonica, Biochem, 77 (4), 411.

上に書いた哺乳類ではD6領域にhidden breakがありますが、他の昆虫や甲殻類ではD7a領域にhidden breakがあるそうです。

この論文は、2生物種のD7a領域のgap region近くをシーケンスしたものです。Terminal deoxynucleotidyl transferaseでcDNAの3末端にpolyG配列を付与して、その配列をもとに28S rRNAの片割れを読む手法など参考になりそう。

28S rRNAのD7a領域内のUAAUという配列が、hidden breakを持つ種に共通しているという知見があったけれど、この論文で調べたアルテミアにはUAAU配列は存在しなかったそうです。

「シロイヌナズナ葉緑体23S rRNAのhidden break形成にはDEAD box proteinが必要」

Nishimura K., Ashida H., Ogawa T., and Yokota A., 2010, A DEAD box protein is required for formation of a hidden break in Arabidopsis chloroplast 23S rRNA, Plant J, 63(5), 766-777.

今度は植物の葉緑体。28Sではなく23S。詳しくは読んでません。後で追記するかも。hidden breakのメカニズムについて。

 「トビケラの絹糸腺リボソームのキャラクタリゼーション」

Nomura T., Ito M., Kanamori M., Shigeno Y., Uchiumi T., Arai R., Tsukada M., Hirabayashi K., and Ohkawa K., 2016, Characterization of silk gland ribosomes from a bivoltine caddisfly, Stenopsyche marmorata: translational suppression of a silk protein in cold conditions, Biochem. Biophys. Res. Commun., 469 (2), 210-215.

こちらもメモ。

トビケラの28S rRNAもD7a領域にhidden breakがあるみたいです。面白いのが、冬にだけ80Sリボソームが分裂してしまうこと。冬は転写活性を抑えるために28S rRNAのhidden breakが発生するのではないか、と考察されてます。

あと、hidden breakとL23a proteinが関係しているかも、という話も始めて知りました。

（追記 2018.02.03）

L23a proteinとhidden breakについて。元ネタのRoss et al. (2007, Nucl Acids Res, 35) をざっと読みましたが、L23aがhidden breakを引き起こしている、というレベルの知見ではなさそう。L23aとリボソームの位置関係と、Hidden breakを持つ昆虫などがL23aに特徴的なドメイン（Histon H1-like domain）を持っていたという系統関係とをもとに考察されただけ？ 上のNishimura et al. (2016) ほど因果関係を詰めているわけではない。

（追記 2018.06.12）

「菌類における26S rRNAの転写後marurationの同定」

Navarro-Ródenas A., Carra A., and Morte A., 2018, Identification of an alternative rRNA post-transcriptional maturation of 26S rRNA in the kingdom fungi, Frontiers  Microbiol, 9.

菌類でhidden breakが見つかったよ、という報告。Desert truffles（砂漠のトリュフ？）の3種で26S rRNAのhidden break周りの塩基配列を読んでいます。

論文のメモ： RT-PCRを始めるにあたって読みたい文献

リアルタイムPCRを用いた遺伝子発現解析の原理、実験手法やデータ解析法について。

いちばん分かりやすく丁寧なのは、タカラやサーモの日本語解説でしょう。特にサーモの「リアルタイムPCRハンドブック」は最高。それらを読んだ後に、将来論文に引用することを想定して読むべき文献は、下のようなものでしょうか。

全般的なことについて

Bustin S.A., Benes V., Garson J.A., Hellemans J., Huggett J., Kubista M., Mueller R., Nolan T., Pfaffl M.W., Shipley G.L., Vandesompele J., and Wittwer C.T., 2009, The MIQE guidelines: minimum information for publication of quantitative real-time PCR experiments, Clinical Chem., 55 (4), 611-622.

論文など公表するときに記載するべきことのリスト。MIQEガイドライン。公表する際のチェックリストですが、実験を始めるときにこれが頭に入ってると良いでしょう。

例えば、逆転写活性の阻害・PCRの阻害をチェックすべし、というのが必須項目に挙げられてますが、ちゃんと実施している論文は結構少ないかも。

実験手法について

Nolan T., Hands R.E., and Bustin S.A., 2006, Quantification of mRNA using real-time RT-PCR, Nature Protocols, 1 (3), 1559-1582.

Nature ProtocolのRT-PCR法まとめ。データ解析法は詳しくないですが、実験手法は一通り詳しく書いてます。

Taylor S., Wakem M., Dijkman G., Alsarraj M., and Nguyen M., 2010, A practical approach to RT-qPCR—publishing data that conform to the MIQE guidelines. Methods, 50 (4), S1-S5.

MIQEガイドラインに則った実験手法まとめ。

リファレンス遺伝子の選択について

遺伝子発現解析は、ハウスキーピング遺伝子群（リファレンス遺伝子）とターゲット遺伝子との発現量の相対比較でおこなうのが主流です。そのリファレンス遺伝子として18S rRNAやβアクチン、GAPDHなどがよく使われていますが、これらの発現量は条件によって変動することが広く知られています。なので、実験系によってリファレンス遺伝子を選び直すステップが必要になります。

では、どのようにしてベストなリファレンス遺伝子を選ぶのが良いのでしょうか。いくつかの方法が提案されています。BestKeeper、NormFinder、geNORMの3つを下に記しておきます。

Pfaffl M.W., Tichopad A., Prgomet C., and Neuvians T.P., 2004, Determination of stable housekeeping genes, differentially regulated target genes and sample integrity: BestKeeper–Excel-based tool using pair-wise correlations, Biotechnol. Letters, 26 (6), 509-515.

BestKeeper。Excelファイルがwebで配布されてます。

リファレンス遺伝子の選択方法はきわめて単純で、基本的に (i) Cp値のばらつきが小さく、(ii) 全部の候補リファレンス遺伝子のCp値の幾何平均と高い相関を示すような遺伝子を、安定的なリファレンスとして選択するというものです。

Andersen C.L., Jensen J.L., and Ørntoft T.F., 2004, Normalization of real-time quantitative reverse transcription-PCR data: a model-based variance estimation approach to identify genes suited for normalization, applied to bladder and colon cancer data sets, Cancer Res., 64 (15), 5245-5250.

次にNormFinder。ExcelのアドインとRスクリプトが公開されてます。 

Vandesompele J., De Preter K., Pattyn F., Poppe B., Van Roy N., De Paepe A., and Speleman F., 2002, Accurate normalization of real-time quantitative RT-PCR data by geometric averaging of multiple internal control genes, Genome Biol., 3 (7), research0034-1.

ソフトウェアgeNORMの元論文。geNORMは有料なので、自分は使っていませんが、そのアルゴリズムは論文を読めばわかるように、割と単純です。リファレンスに使える遺伝子の組なら、その相対発現比はどの細胞・条件でも1に近いはず、という仮定が根底にあるんですね。

(追記)

Rパッケージの"NormqPCR"はgeNORMを装備しているみたいです。もちろん無料。

相対定量の方法について

ΔΔCt法は下の2つをチェックすべし。プライマーの増幅効率が全て2と同等ならばLivakの2-ΔΔCtを用い、増幅効率がプライマーごとに異なるならばPfafflの方法を用いる。

Pfaffl M.W., 2001, A new mathematical model for relative quantification in real-time RT–PCR, Nucleic Acids Res., 29 (9), e45-e45. 

Livak K.J. and Schmittgen T.D., 2001, Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2− ΔΔCT method, Methods, 25 (4), 402-408.  

（追記）

こちらの記事に、発現量の有意差の統計的な検定法について書きました。t検定かノンパラか、など。

論文のメモ： RINは 全ての生物種のRNA分解指標にはできない

動物組織から抽出したRNAの分解度合は、電気泳動によって評価するのが普通です。ヒトなどの場合は、バイオアナライザーという装置で泳動して RIN (RNA Integrity Number; Schroeder et al., 2006) なる指標で分解度を評価します。RINの考え方は、RNAの中で大部分を占めるrRNAの存在比（分解度合）などに基づいて、RNA全体の分解度を推定しようというものです。

ただしRINは、ヒトや哺乳類のRNAを対象とした指標であり、昆虫や甲殻類など一部の生物種には適用できない場合があります（例えば下のWinnebeck et al., 2010）。昆虫や甲殻類の28S rRNAはスプライシング後に"gap deletion"なる現象によって切れ目を入れられて、RNA抽出や泳動前の熱変性の際に2つの断片に分かれてしまいます。そのため本当はRNAが分解していなくとも、28S rRNAが見られないために分解されたとみなされてしまうのです。

「RIN: RNA非分解度の指標」

Schroeder A., Mueller O., Stocker S., Salowsky R., Leiber M., Gassmann M., Lightfoot S., Menzel W., Granzow M., and Ragg T., 2006, The RIN: an RNA integrity number for assigning integrity values to RNA measurements, BMC Mol. Biol., 7 (1), 3.

RNA分解度の評価としてRINを提案した論文。18S rRNAと28S rRNAの量比という指標では分解度を正確に表現できていないという問題を克服するために、RINが開発されたようです。

主にヒト・マウ・ラットのRNAサンプル1208個の波形データを専門家が1~10の分解レベルにカテゴリー分けし、そのカテゴリー分けはどのような特徴量（例：28Sと18Sのピーク高さ比）によってなされているのかをニューラルネットワークを用いて計算しています。ちなみにRINは数字が小さいほど（すなわち1に近いほど）、RNAが分解していることを示します。

ニューラルネットワークの詳細は分かりませんが（というかもはや読んでない）、カテゴリー分けに対する寄与の大きかった特徴量は、順にtotal RNA 比・28Sピーク高さ・28S 面積・fast regionに対する18Sと28S の面積比だそうです。total RNA比とは全RNAに対する18S・28S rRNAの面積比であり、fast regionとは5S と18Sに挟まれた領域のことです。このあたりの特徴量の説明は、Wikipediaにも簡単に書いてありますね。 

「なぜ昆虫のRNAは分解して見えるのか？」

Winnebeck E.C., Millar C.D., and Warman G.R., 2010, Why does insect RNA look degraded?, J. Insect Sci., 10 (159), 1-7.

ミツバチのRNAでRINを測ろうとして、プロトコル通りにRNAを加熱してBioanalyzerに流すと28S rRNAが見えない。RNAが分解したのかと思いきや、そうではない。gap deletion (hidden break) のために28S rRNAが断裂しただけである。なので、RNAは加熱しないで流す。そうすると28S rRNAのピークが確認できるよ、気をつけよう。そんな論文です。 

28S rRNAが断裂するメカニズムについても、既往文献を引用して、まとめられています。

「節足動物における"分解したRNA"プロファイル」

McCarthy S.D., Dugon M.M., and Power A.M., 2015, ‘Degraded’RNA profiles in Arthropoda and beyond, Peer J, 3, e1436.

クモやムカデ・フジツボ類も、28S rRNAは加熱すると分裂するという話。加熱しないで泳動すれば28S rRNAピークも見られると、Winnebeck et al., 2010, J. Insect Sci.と同じようなことを書いています。

ただ自分の経験によると、これはヨコエビには適用できないっぽいです。ヨコエビのRNAは、加熱しなくても28S rRNA分裂が生じます。同様の報告はVidal-Dorsch et al. (2016) もしています*1。

例えば下の図は、あるヨコエビのtotal RNA泳動図です。Bioanalyzerでの泳動前に加熱してませんが、28S rRNAピークは小さくなってしまいます。

なぜこのように生物種によって28S rRNAの切れやすさに違いが生じるのでしょうか。たぶんですが、28S rRNAの配列が異なると二次構造も変化してhidden breakの水素結合部分の強さが変わるからでしょう。

 非モデル生物を扱うときは、本当に予想外のことが生じますね。

*1:著者のDorisさんにメールしたら、Bioanalyzer前に加熱はしてないとのことでした。

生物サンプルの送付依頼

1月ほど前、某国の研究者から遺伝子解析したいので生物サンプル送ってくれないか、という問い合わせメールが来ました。

良いよ～、でもCOI領域なら既に300 bpくらい既に読んであるので配列データ送るね、と返信したところ、1月ほど音沙汰なし。

自分とは異なる研究分野なので、連携出来たら面白いかと思ったけど、まあいっか。こちらからアクションを起こしてまで連携しようという気はないです。

論文のメモ: 化学物質曝露と甲殻類の脱皮

この記事とほぼ同じ内容。

どうも、ZnやCdが脱皮を阻害する発端のメカニズムはCa摂取阻害で説明できそう。Caは殻の材料でもあるし、またCaは脱皮を制御するecdysteroidホルモンをコントロールしているので。

「総説：異物曝露が甲殻類の脱皮に与える影響」

Zou E., 2005, Impacts of Xenobiotics on Crustacean Molting: The Invisible Endocrine Disruption, Integ. Comp. Biol., 45 (1), 33-38.

主にPCBなどの有機物による脱皮阻害についての総説。曝露によってキチン分解にかかわるChitobiaseの活性が低下する原因は、Y器官のecdysteroid receptor EcRが攪乱されるためではないかとのこと（Chitobiaseはecdysteroidによって制御されている）。

「総説：甲殻類の脱皮の制御」

Chang E.S. and Mykles D.L., 2011, Regulation of crustacean molting: a review and our perspectives, General Comp. Endocrinol., 172 (3), 323-330.

MIH（molt-inhibiting hormone）がエクジステロイド合成を制御するシグナル経路のFig. 2が良い感じ。Caがキー。

「総説：甲殻類Y器官におけるEcdysteroidホルモン合成のシグナル経路」

Spaziani E., Mattson M.P., Wang W.L., and McDougall H.E., 1999, Signaling pathways for ecdysteroid hormone synthesis in crustacean Y-organs, Amer. Zool., 39 (3), 496-512.

上のFIg.2はMIHに絞ってますが、こちらのFig.9はecdysteroid合成経路も描かれています。分かりやすい。

H先生の最終講義

先日H先生の最終講義があって、見てきました。先生の半生記とか、学科の歴史とか、研究に対する哲学とかが聞けるかと思いきや、本当にふつうの講義みたいなのをしていました…。いちおう近年の研究の象徴的な話だったようですが、ちょっと残念でした。まあ、H先生らしいのかも。

映画「La La Land」

公開初日に観ました。プレミアムフライデーで。

まあ面白かったです。でも前評判ほどではなかったかな。 

夢追い人の話。ストーリーはありきたりですが、二人がケンカしてからは、けっこう感情移入しちゃいました。ラストの切ない感じは良かったです。もし、元さやに戻るみたいな流れになったらブチ切れてました。

ミュージカルは、その世界に入り込めていないとキツい時がありますね。冒頭、渋滞で止まっている車からみんな出てきて踊りだすんですが、トラックの荷台を開けたら黒人が太鼓たたきながら踊りに参加してきたシーンは思わず笑ってしまいました。荷台で何やってたんだ。あと、プラネタリウムで浮き上がるシーンも。

軽くdisられてたJohn Legendのバンド。普通にカッコ良かったです。

Ost: La La Land

論文のメモ： 金属曝露とヨコエビの繁殖阻害

前回にひき続き、甲殻類への金属毒性のメカニズム勉強中。

「ヨコエビの生殖学と内分泌制御についての総説」

Hyne R.V., 2011, Review of the reproductive biology of amphipods and their endocrine regulation: identification of mechanistic pathways for reproductive toxicants, Environ. Toxicol. Chem., 30 (12), 2647-2657.

曝露によって繁殖能が低下する原因は、ざっくり言うと脱皮の阻害と卵形成（vitellogenesis）の2つ。でも別にこの2つは独立の現象でもなさそうです。例えば、Y器官から分泌されるエクジステロイドは、脱皮もVitellogenin合成も促進するみたい。繁殖能の阻害の報告が多いのはやはり有機ですが、金属類でもCdによる阻害はヨコエビで報告があるとのこと。

総説の主題ではないですが、ω-3脂肪酸が不足すると産仔数が減少するんじゃないかという話は面白そう（→Hyne et al., 2009; Sundelin et al., 2008）。

「金属汚染底質に曝露されたヨコエビの産仔数が減少しても二次卵黄形成は継続される」

Hyne R.V., Mann R.M., Dillon C.T., de Jonge M.D., Paterson D., and Howard D.L., 2013, Secondary vitellogenesis persists despite disrupted fecundity in amphipods maintained on metal-contaminated sediment: X-ray fluorescence assessment of oocyte metal content, Ecotoxicol. Environ. Safety, 93, 31-38.

Pbなど金属曝露による繁殖阻害のメカニズムは、亜鉛を含むタンパクであるVitellogenin（VTG）への亜鉛の結合を他の金属が阻止するからではないか、という仮説を検証した論文。亜鉛・銅・カドミウム・鉛をスパイクした底質にヨコエビを曝露させて、卵巣における金属の分布を蛍光X線分析で調べています。既に抱卵したメスと成熟したオスを曝露させてます。

結果、卵母細胞に亜鉛は分布しているし、control系と曝露系で大きな違いはなさそうで、secondary vitellogenesis（別の場所で作られたvitellogeninが卵巣の卵母細胞に取り込まれること？）は汚染系でも進んでいるというものでした。仮説は否定されたということで、他に有りうる繁殖阻害のメカニズムは、脱皮サイクルの遅れやCa摂取阻害（Muyssen et al., 2006）などではないかとの考察。

 「水生無脊椎動物における金属の毒性・摂取・蓄積―甲殻類における亜鉛」

Rainbow P.S. and Luoma S.N., 2011, Metal toxicity, uptake and bioaccumulation in aquatic invertebrates—modelling zinc in crustaceans, Aquatic Toxicol., 105 (3), 455-465.

以前読んだ総説。ヨコエビOrchestia gammarellusの話。

中国でヨコエビ飼育法の特許がとられてる

いやはや、びっくりした。

ネットサーフィンしてたら、ニホンドロソコエビ(Grandidierella japonica)の飼育法の特許を見つけました。ちゃんと読めてないけど、温度は20～26℃、塩分は10～26にするとか、餌に藻類をあげるとか、そんな感じのことが書かれてます。特許ってこんな分野・内容でもとれるんですね。

この人たち、1998年からこの種に関する論文を出してるみたいですが、全部中国語で、しかもネット上で入手できないという…。なんで英語で書かないのか。

（2017.08.16 追記)

Twitterで言及されてました。似たような飼育法の特許は、他にも色々あるみたいですね。不勉強でした。

ちなみに自分が驚いたのは、ニホンドロソコエビを研究対象にしているから。「論文で引っかからないけど研究されてたのか！」とビックリでした。

ドロソコの特許が中国で取られてたってそんなに驚くことかな…

日本でもワレカラの飼育法の特許があったりしますよ。https://t.co/SnoHB0duRj

— vertical*6 (@vertical06) 2017年4月26日

SciRevに投稿してみた

ここで知ったSciRevというサイトに投稿してみました。

論文を投稿した時の査読にどれだけ時間がかかったか、などの経験談をまとめているサイトです。サンプル数が少ないので、あまり信頼度は高くないです。例えば環境系だと、経験談の最も多い雑誌（Agronomy for Sustainable Development）でも21個の投稿で、次点は9個。たいていの雑誌は1～3個です。まあでも、眺めてるだけで面白いです。 

投稿してしばらく経ってからサイトに反映されます。その間、口コミ内容のチェックを一応しているみたいですね。

Editorから理不尽な扱いを受けた時は、ここでネガキャンして憂さ晴らししてやろうかな。