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a record of inner life

やったことや考えたこと・本・論文・音楽の備忘録。 特に環境科学・生態毒性に関して。

論文「蛍光AFLPを最大限活用する」

論文 分子生物学 AFLP

Vosら(1995)によって開発されたオリジナルのAFLP(Amplified Fragment Length Polymorphism)は、放射性標識されたプライマーを使用していました。しかし蛍光色素で標識する方が、放射性標識より分析は簡易です。

ただ蛍光標識を用いたAFLPをfAFLP(flourescent AFLP)には、次のような課題があるそうです。

  1. 高分子(>200 bp)の断片が見られにくい*1
  2. ピーク強度が安定しない。

そこで、これらの課題に対する解決策として、Selective PCRにおけるプライマー濃度、Taqポリメラーゼの種類、PCRの各ステップの時間などを最適化してみた、という論文です。論文のタイトルは「getting the most out of fAFLP」なんですが、言い過ぎですし、研究内容をもう少し具体的に書いてほしいです。

 

Trybush S., Hanley S., Cho K-H., Jahodova S., Grimmer M., Emelianov I., Bayon C. and Karp A., 2006, Getting the most out of fluorescent amplified fragment length polymorphism, Can. J. Bot., 84, 1347-1354. 

 結果と考察を、メモとして簡単にまとめます。すべてselective PCRの条件について。

  • DNAシーケンサーで得られるAFLPのピークに対して影響の最も大きかった要素は、Taqポリメラーゼ。AmpliTaq Gold PCR Master Mixか、Qiagen Multipulex PCR kitが、良いそう。Selective PCRではhot-startのポリメラーゼを使って、非特異的な増幅を防ぐべき。
  • 鋳型DNAの量はあまりAFLPプロファイルに影響しない。
  • MseI系のプライマー(蛍光標識なしのプライマー)の添加量も、結果に影響しない。
  • 蛍光標識をしているEcoRI系のプライマーの量は、関係あり。多すぎるとプライマーダイマーが生じ、低分子のピークを阻害する。少なすぎると検出されないピークが出てくる。
  • PCRの時間は、あまり関係ない。

 

*1:この論文にはこの理由が書いてないので、さかのぼらないと分からない。