いやはや、びっくりした。
ネットサーフィンしてたら、ニホンドロソコエビ(Grandidierella japonica)の飼育法の特許を見つけました。ちゃんと読めてないけど、温度は20～26℃、塩分は10～26にするとか、餌に藻類をあげるとか、そんな感じのことが書かれてます。特許ってこんな分野・内容でもとれるんですね。
この人たち、1998年からこの種に関する論文を出してるみたいですが、全部中国語で、しかもネット上で入手できないという…。なんで英語で書かないのか。
（2017.08.16 追記)
Twitterで言及されてました。似たような飼育法の特許は、他にも色々あるみたいですね。不勉強でした。
ちなみに自分が驚いたのは、ニホンドロソコエビを研究対象にしているから。「論文で引っかからないけど研究されてたのか！」とビックリでした。
ドロソコの特許が中国で取られてたってそんなに驚くことかな…
— vertical*6 (@vertical06) 2017年4月26日
日本でもワレカラの飼育法の特許があったりしますよ。https://t.co/SnoHB0duRj
「オオミジンコのecotoxicogenomicsによって金属毒性のメカニズムが推察できる」
Poynton H.C., Varshavsky J.R., Chang B., Cavigiolio G., Chan S., Holman P.S., Loguinov A.V., Bauer D.J., Komachi K., Theil E.C., Perkins E.J., Hughes O., and Vulpe C.D., 2007, Daphnia magna ecotoxicogenomics provides mechanistic insights into metal toxicity, Environ. Sci. Technol., 41 (3), 1044-1050.
オオミジンコをCd・Cu・Zn溶液にそれぞれ1/10 LC50で曝露させて、遺伝子発現をマイクロアレイで調べた論文。昔よく読んだ論文ですが、またキチンに関する箇所を読み直し。
キチナーゼhomologous geneが、Zn曝露の時だけ発現が減少してます。キチナーゼの酵素活性も確かに、同濃度のCdとCuよりZnによって、より活性が阻害されてます。キチナーゼが阻害されると、脱皮が上手くできなくなるので最終的には繁殖能も阻害される（からキチナーゼ阻害は良いマーカーになる？）という議論も。
甲殻類の脱皮はホルモンによって制御されていて、有機物曝露によってキチナーゼ活性が阻害される報告はいくつかあったけれども、金属によってキチナーゼが阻害されたというのはこの論文が初めてじゃないか、とのこと。
「オオミジンコの遺伝子発現プロファイリング：NOTEL」
Poynton H.C., Loguinov A.V., Varshavsky J.R., Chan S., Perkins E.J., and Vulpe C.D., 2008, Gene expression profiling in Daphnia magna part I: concentration-dependent profiles provide support for the no observed transcriptional effect level, Environ. Sci. Technol., 42(16), 6250-6256.
上記論文の続き。同じくCd・Cu・Zn溶液に曝露させてマイクロアレイ解析をしてますが、1/10 LC50に加えて1/10 EC50とNOECも追加。濃度は1/10 EC50 < 1/10 LC50 < NOEC。
定量PCRでキチナーゼの発現変動を確認してますが（Table S4）、別に亜鉛特異的ではなく、銅曝露でも発現は減少してます。この結果だけ見ると、上の論文のキチナーゼ活性の部分はう～んという感じ。ただこの論文では、いくつかあるキチナーゼhomologのうち一つしか試験してないので、あくまで酵素活性は亜鉛に特異的なんだという可能性はまだあるかも。
Cuticle proteinもCu・Zn溶液によって発現低下しています（Table S3）。
「転写物プロファイリングによるヨコエビの有害物質応答メカニズム評価」
Hook S.E., Osborn H.L., Spadaro D.A., and Simpson S.L., 2014, Assessing mechanisms of toxicant response in the amphipod Melita plumulosa through transcriptomic profiling, Aquatic Toxicol., 146, 247-257.
汽水産ヨコエビの遺伝子発現をマイクロアレイで解析した論文。銅・亜鉛などを個別にスパイクした底質にヨコエビを48時間曝露させ、生存個体の発現変動を調べてます。ただ曝露濃度は物質ごとに違っていて、「銅＞亜鉛＞ニッケル」の順に毒性影響強い。
キチナーゼやcuticle proteinは銅・亜鉛・ニッケルのいずれによっても発現低下。同様にecdysteroid-regulated proteinの発現も、銅・ニッケルによって低下。キチナーゼはcrude oilとdiesel oil以外の全ての系（ピレスロイド系殺虫剤など）で発現低下しています。
「カドミウムはエクジステロイド含量とキチナーゼ・NAG活性を減少させることで淡水カニの脱皮をさまたげる」
Luo J., Pei S., Jing W., Zou E., and Wang L., 2015, Cadmium inhibits molting of the freshwater crab Sinopotamon henanense by reducing the hemolymph ecdysteroid content and the activities of chitinase and N-acetyl-β-glucosaminidase in the epidermis, Comp. Biochem. Physiol. C: Toxicol. Pharmacol., 169, 1-6.
カニの眼柄（eyestalk）を除去してカドミウム曝露。カニやエビの眼柄にはX器官という脱皮抑制ホルモン（MIH）を合成する部位があるため、眼柄を切除すると脱皮を誘導するエクジステロイド（ecdysteroid）の分泌が促進されるそうです。
そんでこの論文では、眼柄除去した個体にカドミウムを曝露させると、脱皮にかかわるecdysoneやキチナーゼ等の体内濃度が減少したことを確認してます。カドミウムの濃度が7.25 mg/L～29 mg/Lと高めですが、LC50は232 mg/Lともっと高め。
甲殻類の脱皮とホルモンとの関連は、総説読んでもうちょい勉強しよう。
(追記 2017.03.21)
「カドミウムによるカニの脱皮阻害」
Rodriguez Moreno P.A., Medesani D.A., and Rodrıguez E.M., 2003, Inhibition of molting by cadmium in the crab Chasmagnathus granulata (Decapoda Brachyura), Aquat. Toxicol., 64 (2), 155-164.
上と同じくカニの眼柄を除去してCdに曝露させた研究。上の研究より詳しくて面白い。Cd濃度を増加させると、脱皮しない割合が増えます。そのメカニズムを探るために、甲皮中のCa濃度と血リンパ中のecdysteroidレベルを測定しています。抜け殻中のCa濃度は、Cd曝露によって統計的に有意には変化せず、ecdysteroid濃度も同様でした。Ecdysteroid合成が始まる前の成長段階で曝露されないと、脱皮への影響は生じなかったという結果も。
(追記 2017.03.06)
「オオミジンコにおける亜鉛摂食曝露の分子レベル・高次レベルでの影響」
De Schamphelaere K.A.C., Vandenbrouck T., Muyssen B.T.A., Soetaert A., Blust R., De Coen W., and Janssen C.R., 2008, Integration of molecular with higher-level effects of dietary zinc exposure in Daphnia magna, Comp. Biochem. Physiol. D: Genomic. Proteomic., 3 (4), 307-314.
亜鉛汚染藻類をオオミジンコに食べさせて、遺伝子発現や産仔数を調べた論文。
ユニークなのが、脱皮時期・脱皮率のモニタリングをしてる点です。亜鉛曝露の影響が出たのは2回目（3日後）と4回目（6日後）のみで、他の脱皮には影響していない。
亜鉛曝露によってVitellogeninの発現は変動していなくて、影響を受けたのはcuticle metabolism・chitin bindingとミトコンドリア系。ただ影響を受けた時期が違っていて、表皮関連のものは6日後、ミトコンドリア系は13日以降。
Discussionに "Despite this incereasing evidence that metals can also interfere with molting in crustaceans, it remains unclear whether or not this occurs through similar molecular mechanisms as for organic chemicals (e.g., binding to EcR receptor)."との記述あり。
D2のWさん関係で、環境DNAに最近興味あり。
「古腹足類のミトコンドリアゲノム全長配列」
Williams S.T., Foster P.G., and Littlewood D.T.J., 2014, The complete mitochondrial genome of a turbinid vetigastropod from MiSeq Illumina sequencing of genomic DNA and steps towards a resolved gastropod phylogeny, Gene, 533 (1), 38-47.
ミトコンドリアDNAは全長16~18kbほどなので、NGSを用いればde novoでも比較的容易に全長解析できるんですね。この論文では150bpペアエンドのMiSeqで4.1Mリード読んでます。
核・ミトコンドリアを一緒くたにしてではなく、ミトコンドリアのみ抽出してます。抽出法は下の論文から。
(追記2018.11.23)
普通、ミトコンドリアDNAのエンリッチメントはわざわざやらないそうですね。ミトコンドリアの方が多いから、そこまでせずともNGSで全部読めば勝手にミトコンドリアが繋がる場合が多いとか。
(追記終わり)
Tamura K. and Aotsuka T., 1988, Rapid isolation method of animal mitochondrial DNA by the alkaline lysis procedure, Biochem. Genetics, 26 (11-12), 815-819.
Wさんの研究も、いっそ近縁種含めてミトコンドリアDNAを全長解析すれば、より確実で発展性のあるものにできそう。
論文のIntroductionに「底質汚染に対するヨコエビの感受性は高いよ」と書こうとしたけど、意外と根拠になるデータがぱっと思いつかず…。正当化できそうな論文を探してみました。 今更ながら。古い論文多め。
「サンフランシスコ湾のDDT・ディルドリン汚染地点における底質毒性とヨコエビ密度」
Swartz R.C., Cole F.A., Lamberson J.O., Ferraro S.P., Schults D.W., Deben W.A., Henry L., and Ozretich R.J., 1994, Sediment toxicity, contamination and amphipod abundance at a DDT‐and dieldrin‐contaminated site in San Francisco Bay, Environ. Toxicol. Chem., 13 (6), 949-962.
もう20年以上前の論文。昔ちら見したけど、全く内容を覚えてなかった。
カリフォルニアの水路でDDTやディルドリンで汚染された底質をサンプリングし、底生生物叢の調査、化学分析と、ヨコエビE. estuarusの底質毒性試験をおこなった研究。DDTというのが時代を感じさせます。データは結構豊富で、他の生物種の毒性値を使って、底質中物質のTU（固相, 間隙水ともに）を出すなどの力技もしている印象。
野外ヨコエビ密度とlab試験の生存率は、DDT濃度と高い相関を示しているというのがメインン結論。底質中DDT濃度と他種ヨコエビのLC50値を比較して、DDTが怪しいぞ、という話。他の分類群の生物と比較してないので、記事の冒頭の答えにはなってなかったです。
あと、野外で集めたヨコエビのうちGrandidierella japonicaという種のみ、生息密度がDDT濃度と正の相関を示したそうです。室内の生存試験ではG. japonicaの感受性はそれほど低いわけでもないのに、このような結果が出たのは面白い。
「ヨコエビは原油流出が底生生物叢に及ぼす影響を測る良い指標生物」
Gesteira J.G. and Dauvin J.C., 2000, Amphipods are good bioindicators of the impact of oil spills on soft-bottom macrobenthic communities, Mar. Pollut. Bull., 40 (11), 1017-1027.
1992年スペイン北西沿岸で起きた原油流出事故後の底生生物叢の変化を4年間調べた論文です。詳しくは読んでません。
多毛類は事故後もそれなりに数を保っているど、端脚類ヨコエビは3年目まで中々数が増えない。このような野外調査の話は全然分からないけど、日和見的な多毛類？の存在など面白かったです。データ量はありそうなのに、abundanceの解析メインで多様性の解析とかはしてないのかな（自分が分かってないだけでしているのか？）。
「1980年～1983年における南カリフォルニア沿岸での底質環境の変化」
Swartz R.C., Cole F.A., Schults D.W., and DeBen W.A., 1986, Ecological changes in the Southern California Bight near a large sewage outfall: benthic conditions in 1980 and 1983, Mar. Ecol. Progress Ser., 31 (1), 1-13.
いちばん上のSwartz et al. (1994) と同じEPAグループの論文。野外調査についてよく分かってないので、書いてることを鵜呑みにする読み方しかできてません。1971年以降、湾への汚水の排出量が減少したので、その効果が底質中の有害物質量や底生生物量、種数、そして底質毒性（ヨコエビ10-d試験で評価）にあらわれているかどうか、調べてます。
結果はあまりキレイではなくて、こういう野外調査って大変だなぁと思いました（小並感）。排水の流入地点付近では、soecies richnessやbiomassが増えて、感受性の高い種が戻ってきてたそうです。
Long E.R., Buchman M.F., Bay S.M., Breteler R.J., Carr R.S., Chapman P.M., Hose J.E., Lissner A.L., Scott J., and Wolfe D.A., 1990, Comparative evaluation of five toxicity tests with sediments from San Francisco Bay and Tomales Bay, California, Environ. Toxicol. Chem., 9 (9), 1193-1214.
5種の底質バイオアッセイ論文。イガイ・ヨコエビ2種・ウニ・多毛類。
記事の冒頭のような主張をするには、どの論文もちょっと弱いです。シンプルに、「底質汚染と関連してヨコエビ数の減少が報告されている」くらいのことしか書けないかも。他の種と比較してどうこうっていうのは、やはりきちんとしたデータがないと中々言えない。
RパッケージのGOseq。日本語でも、GOseqの使い方の説明はネット上に散見されます。ただ、多くはヒトなどゲノム情報が手に入る生物種を対象にしていて、いわゆる非モデル生物の場合の説明は見かけません。マニュアルを見ても、コードの例までは書いてません。
そこで、非モデル生物の場合のenrichment analysisのコード例を以下に書いておきます。
まずBioconductorからGOseqパッケージをインストールします。そして以下を実行。始めにデータセットを作ります。非モデル生物の場合は、GOをあらかじめBlast2GOなどのソフトで取得しておく必要があります（ここでは適当に設定）。
library (goseq)
map_test <- list( gene1=c("GO:0050790","GO:0004197"), gene2=NA, gene3=NA, gene4=c("GO:0005975","GO:0004553"),gene5=NA,gene6= c("GO:0005975") , gene7=c("GO:0005975"), gene8=NA, gene9=c("GO:0004553"), gene10= c("GO:0004553") )
genelist_test <- data.frame( DEgenes=c(1,0,1,0,1,0,1,0,1,1), bias.data = c(500,6110,2000,410,600, 1000, 4500,1200,400,8010) )
## DEgenesは発現変動したかどうか（1なら変動）を示す
## bias.dataは遺伝子長
rownames(genelist_test)<-c( "gene1", "gene2", "gene3", "gene4", "gene5", "gene6","gene7", "gene8", "gene9", "gene10" )
次に長さの補正。
pwf_test <- nullp(genelist_test[,1], bias.data=genelist_test[,2])
rownames( pwf_test) <- rownames(genelist_test)
最後にgoseq関数でenrichment analysisをおこなう。 ここでuse_genes_without_catの引数をTRUEに設定することが、ゲノム情報のない生物での解析のポイント。
result <- goseq (pwf = pwf_test, gene2cat = map_test , use_genes_without_cat = TRUE, method = "Wallenius")
なおmethodにWallenius分布以外を用いれば、特に遺伝子長は関係ないので、nullp関数の下りはなくてもenrichment解析ができます（pwf_test <- nullp (...)のコードを飛ばして、最後にgoseq (pwf = genelist, ...)と書く）。
結果。
参考にしたページ：Using goseq on non-model organism - how to define genome?
「トキシコゲノミクスから観た複合影響」
Altenburger R., Scholz S., Schmitt-Jansen M., Busch W., and Escher B.I., 2012, Mixture toxicity revisited from a toxicogenomic perspective, Environ. Sci. Technol., 46 (5), 2508-2522.
総説。勉強会のために読み直してみました。”While the number of mixture studies performed seems quite impressive, none of them explicitly tested mixture hypotheses.”と書いてあるように、この総説を読んでも複合影響のメカニズムは「？」な感じです。
研究状況を知るには良い論文（ちょっと古いかもしれないけれど）。河川水や汚染底質などの環境試料に曝露させた生物のmolecular responseを調べた論文は本当に少なくて（表4）、7つしか挙げられてません。金属類やいわゆる環境ホルモンは、比較的研究が多めです。
「ユスリカに対するパーメスリンとCdの複合影響」
Chen X., Li H., and You J., 2015, Joint toxicity of sediment-associated permethrin and cadmium to Chironomus dilutus: The role of bioavailability and enzymatic activities, Environ. Pollut., 207, 138-144.
ピレスロイド系殺虫剤のパーメスリンとCdとは拮抗作用を示したが、それは生物体外における影響（bioavailablity変化）ではなくて、生体内での影響だろうとのこと。Cdの添加によって、抱合酵素のGST（glutathione S-transferase）とカルボキシルエステラーゼの活性が促進されて、パーメスリンの解毒も促進されたのではないか、という考察。ざっとしか読めてませんが、複合影響のメカニズムを考察する例として理解しやすい論文です。本当にこれで十分かどうかは、ちょっと分かりませんが。
続報もありました。co-exposure時のぺーメスリン取り込み量の経時変化などを見ています。
「環境DNAから推察されるジンベエザメ集団の特性」
Sigsgaard E.E., Nielsen I.B., Bach S.S., Lorenzen E.D., Robinson D.P., Knudsen S.W., Pedersen M.W., Jaidah M.A., Orlando L., Willerslev E., Møller P.R., and Thomsen P.F., 2016, Population characteristics of a large whale shark aggregation inferred from seawater environmental DNA, Nature Ecol. Evol., 1, 0004.
500 mL（×3 replicates）の水から、ジンベエザメのミトコンドリアDNA（412 bp, 476-493 bp）の変異を解析した論文。環境DNA（eDNA）って生物種数やバイオマスの調査だけでなくて、遺伝的多様性の解析にも使えるんですね。考えてみれば当然の話かもですが。
帰省中の新幹線で読みました。
感想はずばり「ディープラーニングすごい」。
従来の機械学習ではどのような特徴量（＝説明変数）を用いるかを人間が最終的に設計しなければならなかったのに対し、ディープラーニングは自ら重要な特徴量を設計できるそうです。
例えば、従来の機械学習で猫の画像を認識するためには「耳が2つあってヒゲが生えてて…（適当）」のような判断基準を人間が設定し無ければならなかったのに対し、ディープラーニングではその特徴の把握を自動的にしてくれるみたい(たぶん)。データを与えられると、「猫（の画像）」「人間（の画像）」という概念を自動的に獲得していくので、あとは「その概念は人間の世界で『猫』というものだよ」と教えてもらえればOKだというのです。
ディープラーニングのアルゴリズムは分かったような、分からないような感じですが、そのインパクトの凄さは伝わりました。
自分の人工知能の理解は、上でいう従来の機械学習で完全に止まってました。理論も勉強したいけれど、Rやpythonで気軽にディープラーニングの実装ができるみたいなので、まず動かして遊んでみます。
去年の始めに2016年の目標を書きました（去年の振り返りと 2016年にやりたいこと）。それが実際、どれだけ達成されたのかチェックしてみました。
2016年は、プライベートでも色々変化があって充実してたかな。しかし、まるまる博士論文の執筆に充てられていた数カ月間は、記憶が薄れている…。
上記の現状を踏まえて、2017年のざっくりとした目標を。
具体的に書く。
*1:SETAC Europeに行きたいけど、締め切りまでに出せるネタがない。
