論文のメモ: RNA-Seqの前処理にトリミングは必要ない

タイトル通り。

これまで普通にトリミングしてました。確か（クオリティ）トリミングあり/なしでde novoアセンブリの結果があまり変わらないとかは自分で確認しましたが、mRNA定量への影響はそう言えば検証してませんでした。

こういう「一部では常識」みたいなテクニックを論文化してくれるのはありがたいです。

Answering the question that's been asked on SeqAnswers every month since 2011 https://t.co/MXKUmGYH9v

— Stephen Turner (@strnr) 2019年11月7日

Liao Yang, Wei Shi, 2019. Read trimming is not required for mapping and quantification of RNA-seq reads, bioRxiv, 833962.

上のツイートの論文。遺伝子発現の定量化へのトリミングの影響を調べた既往研究としてDel Fabbroら（2013, Plos One）、Didionら（2017, Peer J）、Williamsら（2016, BMC Bioinformatics）が引用されてますが、相反する結論もあるため、個々の遺伝子についてmore rigorousに調べる必要がある、とのこと。
そもそも多くのマッピングツールは、マップされたリードの端が上手くアラインメントされていなければ除去する（soft clipping）のでアダプターを予め除去する必要はないとのこと。

この論文では、マッピング・定量化ツールにRsubreadを*1、トリミングツールにTrimmomaticとTrimGaloreを使用。ここで言うトリミングとは、アダプタートリミングとクオリティトリミングの両方のこと。そして定量PCRによる発現量との相関などを見ています。

結果、Rsubreadはsoft-clipによってアダプターの90%以上を除去でき、しかもトリミングの有無によるマッピングの差はトリミングツールの差と同程度だったそうです。定量PCRとの比較からは、トリミングをすることでむしろ発現定量結果は微妙に不正確になってしまうとのこと。

Williams CR, Baccarella A, Parrish JZ, Kim CC, 2016, Trimming of sequence reads alters RNA-Seq gene expression estimates, BMC Bioinformatics 17(1): 103.

上の論文で引用されていた研究。ざっとしか読んでません。要はクオリティートリミングを厳しくし過ぎると短いリードが生まれて、そのリードが不適切な配列にマッピングされるから良くない、と言う話。なのでトリミング後のデータは、リード長でフィルタリングしようとも述べてます。マッピングはTopHat2使用。

また、古いRNA-Seqデータは低クオリティーだったりアダプターがコンタミしていたりするため、トリミングすることも有用かも、とのこと。

MacManes MD, 2014, On the optimal trimming of high-throughput mRNA sequence data, Frontiers in Genetics 5: 13.

これはトリミングが（マッピングじゃなくて）de novoアセンブリへ与える影響について。アブストくらいしか読んでませんが、クオリティートリミングするにしてもPHRED score <2や<5を推奨。

*1:ちなみにこの筆者たちはRsubread（とfeatureCounts）の開発者。

論文のメモ: 生態リスク評価におけるEvolutionary Toxicology

化学物質の汚染にさらされたとき、ある生物種の個体群（または複数種の集まりcommunity）が化学物質に対する耐性を持つことは良く知られています。殺虫剤に耐性を持つ蚊や抗生物質の効かない薬剤耐性菌などが特に有名ですね。

耐性を獲得するメカニズムは、耐性のある個体の選択、遺伝子の変異を伴うもの（適応adaptation）、そして表現型の可塑性などがありますが、

Oziolor EM, DeSchamphelaere K, Lyon D, Nacci D, Poynton H, 2020, Evolutionary Toxicology—An Informational Tool for Chemical Regulation?, Environmental Toxicol Chemi 39(2): 257-268.

ET&C誌のPerspective。アカデミア、行政、産業界からそれぞれ 1名ずつが、Evolutionary Toxicologyの研究の現状と生態リスク評価（ERA）におけるEvolutionary Toxicologyの位置づけ（？）や可能性について述べています。

ざっと読んだところ、ERAにおけるEvolutionary Toxicologyの課題は、予測可能なのかということと、解釈が困難であることの2点でしょうか。

まず技術的な課題。要因（多数の生物種や化学物質、濃度レベル、曝露期間、個体群のサイズ、遺伝的多様性の度合い  ）が多様な中でevolution（というか適応？）の程度をどこまで一般化できるか、予測できるか、というもの。定量化の指標には、例えばPICT（Pollution Induced Community Tolerance, 後述）や遺伝的多様性の損失度合いなどが挙げられてます。

次に、ERAにおいてもっと本質的な課題。そもそもEvolutionary Toxicologyを考慮する必要・意義があるのか、あるとすればどのような指標に基づいて評価するのが良いか、群集communityなど高次のレベルに影響はあるのか、など。現象としてEvolutionary Toxicologyがあるのは認めるけど、それって対策するほどなんか？ってことですね。確かに上に挙げた遺伝的多様性の損失などは、リスク管理の目標に現実的にはなり得ない気がします。遺伝的多様性の損失は他のストレス要因に対する適応度が下がる、と考えれば混合物mixtureのリスク評価の1つの指標にはできるかもしれませんが、現状道のりは遠そう。（一方、PICTは光合成活性の低下など群集の機能に着目している点で意味付けはしやすいでしょうか？実際に意味があるかはさておき。）

あとはメモ。数世代で個体群の感受性が低下することは実験的に例がある（Xie & Klerks, 2003, ETC; Ward & Robinson, 2005, ETC）。一時的な曝露（農薬など）によって耐性が生じることもあるため（Major et al., 2018, Evol Appl）、野外調査では要注意。

Schmitt‐Jansen M, Altenburger R, 2005, Predicting and observing responses of algal communities to photosystem II‐herbicide exposure using pollution‐induced community tolerance and species‐sensitivity distributions, Environ Toxicol Chem 24(2): 304-312.

PICTとSSDを比較（？）した論文。

PICTの中身をようやく理解しましたが、汚染によって感受性の高い生物種が減り代わりに耐性のある種が増えることで、群集全体の応答の変化（例えば光合成活性）を対象にしているのですね。別に遺伝子の変異などは考慮していないようです。

なので、種の感受性の変化を想定しないPICTは、従来的なリスク評価の枠組みで考慮可能。SSDと比較して論じることもできます。そしてこの論文のように、SSDで見たときに感受性の高い種を守れば、PICT的にも影響が見られないことになります（ただし両者の構成種が同じでかつ、種間の相互作用がないものとすれば）。

上の総説のEvolutionary Toxicologyは（micro）evolutionによってある種の感受性が完全に変わってしまうことを想定しているので、PICTはちょっとノリが違うかも。

論文のメモ: 種の感受性分布における自己相関の補正

種の感受性分布（Species Sensitivity Distribution; SSD）。

化学物質に対する生物種の感受性は、経験的に対数正規分布にフィットすることが知られています。その性質を利用して累積分布関数で種の感受性を表現したのがSSDです。SSDを利用して5%の種が影響を受ける濃度、すなわちHC5（5% Hazardous Concentration）等を求め、リスク評価をおこなうことができます。

Moore DR, Priest CD, Galic N, Brain RA, Rodney SI, 2020, Correcting for phylogenetic autocorrelation in species sensitivity distributions, Integrated Environ Assess Manag 16(1): 53-65.

SSDはデータが独立であることを仮定しているが、多くの解析でその仮定は守られていません。近縁種は化学物質に対する感受性も似通っていますが、近縁な複数の種のデータを一緒くたにして解析することは珍しくありません。つまり自己相関（autocorrelation）のあるデータがそのまま頻繁にSSDに持ち込まれています。

殺虫剤クロルピリフォスと除草剤アトラジンを例に、自己相関を考慮して求めたHC5と考慮していないHC5とを比較したのが上記論文です。具体的には、自己相関があると有効サンプルサイズが減少するため（neff -> neff'）、neff'を用いて対数正規分布の分散を求め直し、補正しています。遺伝的距離をもとに自己相関の程度を求め、neff'を求めているのですが詳細は正直理解できませんでした。

結果、もともとのサンプルサイズが30個ほどある場合には、自己相関の考慮によってHC5の値はほぼ影響を受けませんでした（Fig.3の赤と青が完全に重なっている…）。サンプルサイズが9個の場合でも自己相関がなければ同様。サンプルサイズが少なくて自己相関の高い極端なデータセットの場合にのみ影響があるとのこと。

USEPAが開発している、DNA配列から種の感受性を予測するプログラムSeqAPASS（LaLone et al., 2016）は、このような補正に使用されるのが現実的な落としどころかと思ったり。でも論文の結論は地味でした。

論文のメモ: ヨコエビのオスはどのようにしてメスを認識しているか？

Holmes SJ, 1903, Sex recognition among amphipods, Biological Bulletin 5(5): 288-292.

論文というかエッセイのような書き物。

ヨコエビのメスは脱皮直後にしか産卵しないため、オスはその瞬間を逃さぬようメスを背後から抱きかかえて過ごします。この行動は交尾前ガードと呼ばれています。交尾前ガードに至る前に、オスはどのようにしてメスを認識しているのか。その疑問を追求した論文です。筆者はヨコエビとしてHyalellaを使用してます。

まず視覚によって認識しているかどうかを検証すべく、オスの眼を黒く塗ってみたところ、すぐに交尾前ガードが観察されました。視覚が要因ではないようです。

次に嗅覚かどうかを検証すべく、匂いを感じる第一触覚を切ってみたところ、やはり変わらず交尾前ガードが観察されました。嗅覚でもないようです。

では何か。ヨコエビの動きを観察してると、オスは別にメスを追い回しているわけではないことが分かります。ただヨコエビは泳いでいると、他の個体とよく衝突します。その際、メスは（メス同士でも）丸まってじっとしてますが、オスは（オス同士でも）相手を掴もうと動き回ります。

この反応の違いこそ、交尾前ガードの要因のようです。検証のため、オスの第二顎脚を切断して抵抗できないようにしてみると、見事健全なオスによって掴まれてしまったそうです。

論文のメモ: ナノマテリアル曝露に共通する遺伝子発現パターンのメタ解析

Burkard M, Betz A, Schirmer K, Zupanic A, 2019, Common gene expression patterns in environmental model organisms exposed to engineered nanomaterials: A meta-analysis, Environ Sci Technol 54(1): 335-344.

スイスからの論文。

ナノマテリアルに曝露した生物のマイクロアレイデータのメタ解析。シロイヌナズナと線虫（C. elegans）とゼブラフィッシュを一緒に論じるという剛腕っぷり。3種で計11件のメタ解析。レビュー論文を書く代わりにメタ解析してみたよ、という感じなのでしょうか。

エネルギー生成、DNA代謝、シグナリングが複数の生物種、ナノマテリアルに共通のGO（Gene Ontology）だったそう。ナノマテリアルの影響としてベタな酸化ストレスと遺伝毒性も観察されたそうです。あまり報告例のない影響として、タンパク質のミスフォールディングやDNA/RNAのメチル化が挙げられてます。

こういうGOのfunctional analysisって影響を概観するには良いけど、AOP的にどういうパスウェイ・メカニズムなのか、を考えるには適してないですね。結局泥臭く考えるしかない。例えば本文で「ミトコンドリアダメージ→ROS生成→酸化ストレス→DNAダメージ」という流れが語られてますが（これはすごくベタですが）、こういう流れは論文中で実施されてるメタ解析だけでは見えません。

あと手法について。古典的なDEG（differentially expressed genes）検出法（FDR補正p値とFold change）だとDEGの数が少なすぎて議論できないから、代わりにFold changeベースの手法（FCROS; Dembele & Kastner, 2014）でDEGを選び出してます。これはメタ解析論文ではよく見る流れ。

「わたしを離さないで」感想

ノーベル賞受賞前からM氏にオススメされていたけどスルーしていたカズオイシグロ。「合成生物学の衝撃」で引用されていて、俄然興味が出て読みました。ちなみに「合成生物学の衝撃」は生物学の話はほぼなくて、期待外れでした（ちゃんとレビューを確認してから読めばよかった）。

読み応えありました。1/3くらいまでは退屈で非常にじれったく感じましたが、後半は引き込まれていきました。

何が面白いのか。小説としての世界が完成しているから？

三十一歳になったキャシーが過去を振り返るという体で物語は進んでいきますが、この語り口が絶妙なんですよね。小説の中の世界の人に語っているため、全然説明をしない。冒頭から提供者、介護人、ヘールシャムというキーワードをぶち込んでくるけど、それらの説明はほぼない。最後まで読んでも、「提供」のシステムの直接的な説明はキャシーからはなされず、保護官のセリフを通して間接的になされるだけ。

実はこれが良いのかも。間接照明しかない中を歩いていく感じ。想像で全体像が補完される感じ。下手に「提供」の設定を説明されても興ざめするかもしれません。

ヘールシャムの子どもたちが、じわじわと提供のことを知るのもリアルです。全貌が理解できない子どものうちから世界の在り方を教わるので、「そういうものだ」と受け入れていく。強い反発がない。キャシーの語り口と相まって、淡々と物語は進んでいきます。

ドラマチックなことは特に起きないけれど、全体的にどこか美しい思い出としてパッケージされている。そんな不思議な印象があります。

最初から提供のことをほのめかして、その謎がすべて解明されるのは終盤（大筋は序盤で明かされます）。そういう点では推理小説的ですが、本書の面白さの肝は謎解きではありません。実際、自分は「合成生物学の衝撃」から本書を読んでるので、ほぼネタバレしてましたが、楽しめました。再読してもまた楽しめそう。シンドイから多分やりませんが。

わたしを離さないで (ハヤカワepi文庫)

論文のメモ: さよならゲノムペーパー

ある生物のドラフトゲノムをどこに公開しようかと思ってたら、こんな論文見つけました。

Smith DR, 2016, Goodbye genome paper, hello genome report: the increasing popularity of ‘genome announcements’ and their impact on science, Briefings in Functional Genomics, 16(3), 156-162.

シーケンシング解析のコストの低下によって、ゲノムを解読したというだけでは論文にならなくなっています。代わりに、多くのジャーナルが"genome report"（呼び名はジャーナルによって様々）というカテゴリーを作り、簡潔で短い原稿を受け付けてます。

Smithさんによると、下のジャーナルがgenome reportを受け付けているそうです。

• Genome Biology and Evolution
• Molecular Ecology Resources
• Standards in Genomics Science（バクテリア・アーキア対象）
• The Journal of Biotechnology
• Microbiology Resource Announcements（Genome Announcementsから名称変更）
• Mitochondrial DNA

しかし調べてみると、Molecular Ecology Resorcesは"Genomics Resources Notes"を廃止し、The Journal of Biotechnologyも"Genome announcement"というカテゴリーを"Short Genome Communications"に変更し、結局今は廃止している（？あまり分からなかったので自信なし）ようです。

バクテリア等のゲノムは知りませんが、Scientific ReportsやScientific Dataがこれらの受け皿になってるのかな。Sci Repでは「ゲノム読んだよ～」論文を結構見ます。しかしAPC $1870は高い…。もっと気軽に投稿したいものです。

論文のメモ: RNA-Seq論文では条件をちゃんと報告しよう

RNA-Seq Blogで紹介されていた論文。

Simoneau J, Dumontier S, Gosselin R, Scott MS, 2019, Current RNA-seq methodology reporting limits reproducibility, Briefings in Bioinformatics.

RNA-Seqをおこなって、生データのリポジトリ場所・前処理ツール・アラインメント手法（or de novo）・リファレンス配列の入手先・アラインメントツール・定量方法をきちんと書いてない論文多すぎ、という注意喚起。

RNA-Seqの解析ツールは常に新しいものを追い求めよ、と書いていてマッピングツールであるTopHatとHISATの比較をしてます。TopHatは開発が打ち切られ、その後継としてHISTAが指定されていますが、未だTopHatを使い続けている論文が出ているそうです（下図）。

でも、使い続ける気持ちは分かります。論文のタイトルにあるようなreproducibility再現性を確保したければ昔のツールと併用して比較しなければならないし。

Please stop using Tophat https://t.co/Es4ohxOEyx Cole and I developed the method in *2008*. It was greatly improved in TopHat2 then HISAT & HISAT2. There is no reason to use it anymore. I have been saying this for years yet it has more citations this year than last #methodsmatter

— Lior Pachter (@lpachter) 2017年12月2日

 

「海外で研究者になる-就活と仕事事情-」感想

別に海外で就職したいとは思ってませんが、評判良かったので。

筆者の在籍しているイギリスと、アメリカの大学の話多め。文系の研究者のインタビューもありますが、どちらかというと理系の話がメインです。

海外の大学に就職するのは、難しそうだと改めて思わされました。例えばイギリス式の候補者5、6人が同時に面接に呼ばれて会食を行う（p.46）、とかまぁきつそう。日本語でさえそんな場面で会話に入れる自信がないのに、英語でとか無理ゲーにもほどがあります。

イギリスの大学では、担任制（チュートリアル）があり、教員は学生のケアに結構なエフォートを割かなければならないらしいです（p.135）。また授業内容を学生から逆評価されるため、手を抜けない（p.124）。一方で、会議の時間は圧倒的に日本より少ないみたいですが、研究に使える時間が日英でそれほど大きく変わるわけではなさそうです。

就職するかどうかはさておき、世界の色んな人と交流できるのは研究者という生き方の魅力の一つだと思うし、海外で研究生活を送ってはみたいです。

海外で研究者になる-就活と仕事事情 (中公新書)

論文のメモ: 等脚類のheteroplasmy

ここに書いた話の続き。

ある未知生物のDNAからミトコンドリアCOI様配列が見つかった時、それが本物のCOI配列の場合もあれば、核DNA配列の場合もあれば、バクテリア配列のコンタミの場合もあります。さらにヘテロプラスミー（heteroplasmy）の可能性もあります。ヘテロプラスミーとは、1個体（というか1細胞）の中に複数のミトコンドリアの遺伝子型genotypesが見られる現象のことです。

Doublet V, Souty-Grosset C, Bouchon D, Cordaux R, Marcadé I, 2008, A thirty million year-old inherited heteroplasmy, PLoS One 3(8): e2938.

卵子が形成される過程でミトコンドリアの数が激減するため、通常は（哺乳類では？）ミトコンドリアのheteroplasmyは世代を超えて受け継がれないそうです（＝homoplasmyのまま）。しかし、この論文のダンゴムシではheteroplasmyが世代を経て観察されています。

面白いのが、直鎖状と環状のミトコンドリアが共存していて、環状のもの（28kb）は直鎖状のもの（14kb）が二つ合わさって形成されているということ（Raimondら, 1999）。ゲノムって学べば学ぶほど訳わかんないですね。この本を読んで以降、ゲノムの複雑さに関する話題にとても興味あり。

numtの論文を読んでいる時、「どうしてnumtとheteroplasmyを区別できるのか」あるいは「Stop codonがない=偽遺伝子ではない=heteroplasmy、という論理をとっている論文が多いが、核DNA配列でもstop codonが見つからない場合もあるのでは？」と思ってましたが、この論文はちゃんとミトコンドリアを単離した上でPCRしてます。

（2019.12.20 追記）

「ミトコンドリアDNAをエンリッチすることでnumtのコンタミを減らす」

Wang D, Xiang H, Ning C, Liu H, Liu JF, Zhao X, 2019, Mitochondrial DNA enrichment reduced NUMT contamination in porcine NGS analyses, Briefings in bioinformatics.

上に書いた、numtとheteroplasmyの区別に関する疑問に関連して。

ミトコンドリアをハイブリベースのCapture kitまたはLong-PCRでエンリッチしてNextSeq 500で読んだ配列と、whole genomeをHiSeq 2000で読んだ配列（WGS）を比較して、WGSは当たり前だけどnumtを多く検出してしまうのでミトコンドリアDNAの変異検出には向かないよ、という話。Long-PCRでもいくつかミトコンドリアDNAではない変異（＝numt）を検出してしまうようです。

（2020.01.19 追記）

「まるでジグソーパズルなミトコンドリアDNA」

Marande W, Burger G, 2007, Mitochondrial DNA as a genomic jigsaw puzzle, Science 318(5849): 415-415.

上のダンゴムシよりもっと複雑かも。ディプロネマという生物のミトコンドリアDNAは100以上のclass A（6 kbp）とclass B（7 kbp）に大別できる染色体からなっている。Class AとBの両方に同一の遺伝子の断片が載っていて、転写後にconcatenationして一つのcDNAとなるそうな。う〜ん、すごい。

この生物種のミトコンドリアDNAについては割と論文出てるみたいです。