「交通関係の汚染に曝露されたブラウントラウトの肝臓の遺伝子発現プロファイル」
Meland S, Farmen E, Heier LS, Rosseland BO, Salbu B, Song Y, Tollefsen KE, 2011, Hepatic gene expression profile in brown trout (Salmo trutta) exposed to traffic related contaminants, Sci Total Environ, 409(8), 1430-1443.
久しぶりに路面排水関係の論文。
トンネルの洗浄水に曝露させたブラウントラウトの肝臓の遺伝子発現をマイクロアレイで調べた論文。何が分かったかとなると微妙…。化学分析の結果、というか実験を始めるまでの想定で大体のことは分かってる気がする。一応adverse outcomeにつながるまでの想定pathwayを描いてます。
重み付き遺伝子共発現ネットワーク解析（WGCNA; weighted gene co-expression network analysis）のはなし。
「遺伝子共発現ネットワークによるDaphniaの繁殖影響予測」
Asselman J, Pfrender ME, Lopez JA, Shaw JR, De Schamphelaere KAC, 2017, Gene co-expression networks drive and predict reproductive effects in Daphnia in response to environmental disturbances, Environmental Sci Technol, in press.
殺虫剤とシアノバクテリアのbinary mixtures (全144サンプル) に曝露させたミジンコのマイクロアレイデータと産仔数データを、WGCNAで統合して分析してます。目的は、遺伝子発現データからmixture exposureの産仔数を予測したい、というもの。産仔数と相関のない遺伝子モジュールを省いていき、予測精度を上げていく流れ。最終的には一般化加法モデル (GAM) で予測。
Mixureだと産仔数の予測精度が低下するなど結果自体の新鮮さはあまりないかもですが、モデルの交互作用項で遺伝子発現レベルの複合影響を考慮するという手法など面白い。
「オオミジンコの初期転写反応は甲殻類特異的な遺伝子ネットワークに位置する」
Orsini L, Brown JB, Shams Solari O, Li D, He S, Podicheti R, Stoiber MH, Spanier KI, Gilbert D, Jansen M, Rusch D, Pfrender ME, Colbourne JK, Frilander MJ, Kvist J, Decaestecker E, De Schamphelaere KAC, Meester LD, 2017, Early transcriptional response pathways in Daphnia magna are coordinated in networks of crustacean specific genes, Mol Ecol, in press.
オオミジンコDaphnia magnaを12種のストレス（シアノバクテリア, 金属, 殺虫剤, 低pHなど）にそれぞれ曝露させ、RNA-seqした論文。オオミジンコは3つのgentotypeを使用してます。
この論文の結果の一つは、2011年ScienceのD. pulexゲノム論文の確認。 すなわち、環境ストレスによって発現変動した遺伝子は甲殻類特異的だということ。さらにgenotypeにも特異的だそうです。この論文では甲殻類crustaceansと言っているけど実際はD. pulexとD. magnaしか相同性検索に使用してないので、環境ストレス応答遺伝子が系統によって異なるのはDaphniaに限った話じゃないかと思ったのですが、C. elegansでも報告されている話らしい（Zhou et al., 2015, Genomics）。
ストレス曝露によって発現変動した遺伝子の解析（DEG解析）では、キチン・表皮の考察話が多い。これは正直知見が多くて、議論しやすいから議論されてるだけな気もしますが。Zebrafishのメタ解析の論文と同じく、DEG解析ではあまり多くのストレス応答遺伝子を見つけられなかったので（全処理で変動したのは1,396genes; およそ全3万遺伝子中）、追加でWGCNA解析をしてます。WGCNAでモジュールを調べることで、アノテーションのない遺伝子の機能を推測できるかも、という話ですが、いまいち結論が見えにくい…。データが膨大過ぎて解析が追いついていない感。
以下、WGCNAの勉強。
超絶初心者の自分用メモです。ご容赦ください。
共起発現ネットワークについては、英語版wikiが分かりやすい。発現量の相関係数sijを計算し、その相関係数がある閾値を超えたら1、閾値以下なら0というルールに従って隣接行列に変換する。
ただWGCNAでは、隣接行列は2値（0 or 1）ではなく、連続値（相関係数sijの累乗sij^a）を用いるそうです。ここが"weighted"たる所以だそうな。どうやって指数aを求めるかは元論文のZhang and Horvath (2005) を見ましょう（適当）。RのWGCNAパッケージだとpickSoftThreshold関数で求められるっぽい。
モジュール（=関連のある遺伝子の集まり）の決め方は普通の階層的クラスタリングでもOK。課題は、どこでクラスターを切るか。
以下、RのWGCNAパッケージを使った解析の練習。下のパッケージ開発の論文とその詳しいチュートリアル（ここ）とを見ながらやってみました。
Langfelder P, Horvath S, 2008, WGCNA: an R package for weighted correlation network analysis, BMC Bioinformatics 9(1): 559.
チュートリアルのデータは複雑なので、まずもっと簡単なデータとして先ほどの遺伝子共起発現ネットワークのwikiページのものを使います。
data <- matrix( c(43.26, 166.6, 12.53, 28.77, 114.7, 119.1, 118.9, 3.76, 32.73, 17.46, 40.89, 41.87, 39.55, 191.92, 79.7, 80.57, 156.69, 2.48, 11.99, 56.11, 5.05, 136.65, 42.09, 236.56, 99.76, 114.59, 186.59, 136.78, 118.8, 21.41), nrow=10, ncol=3)
rownames(data)<- c("G1","G2","G3","G4","G5","G6","G7","G8","G9","G10")
adj <- abs( cor(t(data) , method="pearson") )
隣接行列adjは次のようになる。
G1 G2 G3 G4 G5 G6 G7 G8 G9 G10
G1 1.000 0.234 0.610 0.706 0.029 0.353 0.860 0.998 0.971 0.366
G2 0.234 1.000 0.627 0.523 0.979 0.992 0.295 0.295 0.458 0.990
G3 0.610 0.627 1.000 0.992 0.774 0.525 0.929 0.559 0.405 0.513
G4 0.706 0.523 0.992 1.000 0.687 0.413 0.969 0.660 0.518 0.400
G5 0.029 0.979 0.774 0.687 1.000 0.945 0.485 0.092 0.265 0.941
G6 0.353 0.992 0.525 0.413 0.945 1.000 0.174 0.412 0.565 1.000
G7 0.860 0.295 0.929 0.969 0.485 0.174 1.000 0.826 0.714 0.160
G8 0.998 0.295 0.559 0.660 0.092 0.412 0.826 1.000 0.985 0.425
G9 0.971 0.458 0.405 0.518 0.265 0.565 0.714 0.985 1.000 0.577
G10 0.366 0.990 0.513 0.400 0.941 1.000 0.160 0.425 0.577 1.000
pairs(t(data),cex=3,cex.axis=2,pch=21,bg="grey")
始めは、重みづけなしの共起発現ネットワークで処理する。0.8を閾値とします。
adj2<- ifelse ( adj > 0.8, 1,0)
# sna packageで描画
library(sna)
gplot(adj2,usearrows=FALSE, displaylabels=TRUE)
試しに閾値の取り方を変えてみると、ネットワークのつながり方も大きく変化します。
次にWGCNAパッケージを使用。
sft = pickSoftThreshold(data, dataIsExpr = TRUE)
# Sclale-free topology fit indexを描画
plot(sft$fitIndices[,1], -sign(sft$fitIndices[,3])*sft$fitIndices[,2],
xlab="Soft Threshold (power)",ylab="Scale Free Topology Model Fit,signed R^2",type="n",
main = paste("Scale independence"))
text(sft$fitIndices[,1], -sign(sft$fitIndices[,3])*sft$fitIndices[,2],
labels=powers,col="red")
20乗（power=20）してもScale-free topology fit indexが0.4程度と低いまま。FAQにその対処法が書かれてますが、今回は相関係数の絶対値を取っているunsigned networkなので、FAQに従いpowerを9とします。
このあたりから、かなり手探り状態…。
adj_w <- adjacency ( t(data),power=9 )
# snaで描画してみる, 辺の太さは隣接行列の大きさに従う
gplot(adj_w, usearrows=FALSE, displaylabels=TRUE, edge.lwd=adj_w*2)
太い辺edgeに注目したら、上のunweightedの場合のネットワークとほぼ同じですね。
次にクラスタリング。
TOM = TOMsimilarity(adj_w)
dissTOM = 1-TOMgeneTree = hclust(as.dist(dissTOM), method = "average")
sizeGrWindow(12,9)
plot(geneTree, xlab="", sub="", main = "Gene clustering on TOM-based dissimilarity",hang =-1)
# 枝の剪定
dynamicMods = cutreeDynamic(dendro = geneTree, distM = dissTOM, deepSplit = 2, pamRespectsDendro = FALSE, minClusterSize=2)
dynamicColors = labels2colors(dynamicMods)dynamicColors
[1] "blue" "turquoise" "brown" "brown" "turquoise" "turquoise" "brown" "blue"
[9] "blue" "turquoise"
最後にeigengene。Eigengeneとは、各モジュールにおける第一主成分のことらしいです。モジュールを代表するような発現だと考えて良いみたい。
MEList = moduleEigengenes( t(data), colors = dynamicColors)
MEs = MEList$eigengenes
MEDiss = 1-cor(MEs)
METree = hclust(as.dist(MEDiss), method = "average")plot(METree, main = "Clustering of module eigengenes", hang=-1)
#blueはGene1,8,9で、brownはGene3,4,7。
疲れたので、とりあえずここまで。
あとは、遺伝子発現以外の情報（生態毒性だと致死率・繁殖阻害・成長阻害とか）と各モジュールとの関係を見るなどの解析をして、面白いモジュールを見つけるのが王道でしょうか。
ちなみに同じ発現データの相関を取ってMDSプロットしてみた場合。
library(MASS)
p<- isoMDS( 1-abs(cor(t(data))), k=2, maxit=100)
plot(p$points, type="n",cex.axis=1.5,cex.lab=1.5)
text(p$points, rownames(p$points), col="red",cex=1.5)
2017年の振り返りと、今年2018年にやりたいこと。
2017年は 、学位取得後ポスドクとして過ごした初めての年でした。ただ所属は変わってないこともあって、正直まだまだ学生気分で適当にやってます。2017年の始めに書いた目標（去年の振り返りと2017年にやりたいこと）がどれだけ達成できたかをチェックしてみました。
研究面での総評。反省。
論文を4報出すなど（うち1報は2016年アクセプトですが）、アウトプットについては満足ですけど、研究が進んだという実感はあまりないのが残念なところ。論文を出すための在庫整理的な実験が多かったかも。所属変更までに終えなければならないのである程度は仕方ないですが…。
並行して新しいことを始められれば良かったのですが、在庫整理的なテーマで今年度から研究費を取ってしまった？ので時間をかけない訳にはいきませんでした。上の目標達成度合いの"△"が多くなった理由はこれ。エフォートの安売りは身を亡ぼしますね。身の丈に合った研究計画を心掛けなければ。
今年の目標。
4月からの所属は未だ確定していないので（!）、ひとまず3月までの目標を。
「化学物質曝露後のゼブラフィッシュ胚のトランスクリプトーム：メタ解析」
Schüttler A, Reiche K, Altenburger R, Busch W. 2017. The transcriptome of the zebrafish embryo after chemical exposure: a meta-analysis. Toxicol Sci, 157 (2), 291-304.
ゼブラフィッシュ胚を化学物質に曝露させてマイクロアレイ解析した論文全33報のメタ解析。対象とした物質は全60個。全ての曝露物質で共通して発現変動する遺伝子（DEG）があるか、探してます。始め、DEGの選別基準をt検定での有意性としていたけれど、それではばらつきが大きくて共通のDEGは見つからなかったので、効果量 (effect size) を元にDEGを選別したところCa循環関連遺伝子の発現が多くの曝露系で低下していたという結果。Narcosis毒性の論文でも、Ca関連の遺伝子はいろんな物質曝露によって影響を受けやすいと述べられてました。この論文の考察でも述べられてるけど、AOP (Adverse Outcome Pathway) を発展させるためにはこのCa循環のようにどの反応でも出てくるものとspecificなものを区別するのが大事なんでしょう。
t検定ベースではDEGを見つけられないので、単一の遺伝子に基づいた分析でなく複数遺伝子をまとめたエンリッチメント解析やネットワーク分析をやろう、と薦めてるのにこの論文ではそれらをやっていない。。。もしかしたら既に別の論文を準備しているのかも。
（追記2020.10.03）
その後、こういう論文が同じグループから出てました。https://doi.org/10.1093/gigascience/giz057
ヨコエビは負の光走性だが、産まれたばかりの個体は正の光走性だと前回の論文にありました。自分の飼っているヨコエビは歳をとるほど穴に潜らなくなるので、てっきり逆かと思ってました。この現象に光走性は無関係で、別の要因が関係しているのかも。
「底質毒性試験条件下でのHyalella aztecaの穴掘り行動」
Doig LE, Liber K, 2010, An assessment of Hyalella azteca burrowing activity under laboratory sediment toxicity testing conditions, Chemosphere 81:261-265.
底質の種類、明暗条件、個体の成長段階、餌条件を変えて穴掘りへの影響を調べています。砂が多い底質より泥っぽい方がよく潜り、餌をあげた方がよく潜るという結果。あと小さい個体の方が穴に潜りがち。これらは自分の観察結果と一致してます。
明暗での差は明確ではなかったそうです。一度潜ったら外の環境が明るかろうが暗かろうが関係ないのかな。なぜ加齢とともに潜らなくなるのかは結局不明。
「淡水ヨコエビH aztecaを用いた底質の影響試験：labと実際のギャップ」
Wang F, Goulet RR, Chapman PM, 2004, Testing sediment biological effects with the freshwater amphipod Hyalella azteca: the gap between laboratory and nature, Chemosphere 57:1713-1724.
Hyalella aztecaは本当は泥を食べてないから底質に毒性があることを示す試験生物種には適切ではないよ、というミニレビュー。H. aztecaが泥に潜るということに関してlab間で観察結果が異なっていて、もしかしたらcryptic speciesの問題かもしれないとの議論も。
「非致死エンドポイントとしての潜掘能の解析」
Siebeneicher S, Wahrendorf DS, Wetzel MA, Jungmann D, 2013, Analysis of burrowing ability as a sublethal endpoint in a marine sediment bioassay with Corophium volutator (Pallas). J Soils Sediments 13:197-206.
成体のオスの穴掘りが最も遅いというシンプルな論文。それでも平均約10分で穴を掘り終わっている様子。メスと亜成体は1~3分以内で穴を掘り終えてます。オスは穴に入っているメスを探し出して穴の中で交尾するため、自分では穴を掘らないらしいです。この種のこのあたりの繁殖に関する行動はFish&Mills (1979) に詳しいみたい。
ヨコエビが出てくる論文。生態毒性と関連するのもあったり、なかったり。
Guler Y, Ford AT, 2010, Anti-depressants make amphipods see the light, Aquatic Toxicol 99:397-404.
選択的セロトニン再取り込み阻害作用を持つ抗うつ剤フルオキセチンを海産ヨコエビEchinogammarus marinusに曝露させ、その行動変化を見た論文。曝露によって光走性と重力走性を示すようになったそうです。ただ濃度と走性の関係は単調増加ではない。
他にも寄生虫による寄生、セロトニン曝露などによる影響も調べています。寄生虫が体内のセロトニンレベルを調節して行動を変化させるという知見をもとに、この研究も始まっているっぽい。あとジクロフェナックとカルバマゼピンも調べられてますが、明確な影響は見られなかった様子。
この行動変化が、どれくらい生態学的に重要なのかは結構難しそう。意外とヨコエビでも、行動の変化がエンドポイントに使われてるのを知りました（例えばこれ）。
「ヨコエビの光走性と共食い」
Hunte W, Myers RA, 1984, Phototaxis and cannibalism in gammaridean amphipods, Mar Biol 81: 75-79.
Gammarus属の3種ヨコエビは、加齢とともに負の光走性を示し始めたという論文。共食いの餌食にならないよう、幼体は成体と棲み分けているのではないか、とのお話し。
「ヨコエビの血縁認知」
Patterson L, Dick JT, Elwood RW, 2008, Embryo retrieval and kin recognition in an amphipod (Crustacea), Animal Behaviour 76:717-722.
あまりちゃんと読んでませんが、ヨコエビの育児嚢brood pouchから卵を奪った後でそっと戻し、それを共食いするか観察するという鬼畜な実験。親が産んだものではない卵を戻した時に共食い率はどうなるか、がメインの目的です。カッコウの托卵みたいな実験。ちなみにこの論文のretrieveって何かと思ったら、このヨコエビApherusa jurineiは卵を育児嚢から出し入れできて、育児嚢に戻すことをretrieveと呼ぶみたいです。ヨコエビは一般に卵を育児嚢で孵化させるという"passive"なケアをしますが、この種は卵をcurlしたりstrechしたり"active"なケアをするとか（どんな感じかあまりイメージできていない）。
自分の卵以外はあまりretrieveせず、さらに共食いしてしまうという結果。でも自分の卵でも結構共食いしている…。
「陸生ヨコエビの共食いと食物量」
Duarte C, Jaramillo E, Contreras H, Acuña K, 2010, Cannibalism and food availability in the talitrid amphipod Orchestoidea tuberculata, J Sea Res 64: 417-421.
ハマトビムシの共食いについて。亜成体は成体に食べられてしまうという実験結果です。ただ餌があると、その共食いの効果は減少するそうです。亜成体しかいない系だと餌ある条件の方が致死率高いのが面白い。餌の量が十分だったのかは気になります。
上のHunte and Myers, 1984と似たような、成長段階での棲み分けについてもイントロで語られてます。
「Gammarus pulexは子ども食いを避ける」
Lewis SE, Dick JT, Lagerstrom EK, Clarke HC, 2010, Avoidance of filial cannibalism in the amphipod Gammarus pulex, Ethology 116: 138-146.
産仔したばかりのメスは、オスや産卵前のメス、抱卵しているメスに比べて共食い（亜成体食い）をあまりしないという報告。抱卵したばかりのメスは、オスよりむしろ共食いをしています。
「底質中の金属毒性の予測」
Simpson SL, Batley GE, 2007, Predicting metal toxicity in sediments: a critique of current approaches, Integr Environ Assess Manag 3:18-31.
総説。以下に簡単なまとめ。
生物ってなんでもありだな、というのが一番の感想。
進化は突然変異と自然選択だけではなく、共生発生や異種交配、エピジェネティクスによっても生じる。そしてウイルスは共生発生による進化の大きな推進力になっている。端折りまくった本書の概要は、おおよそこんな感じです。著者は医師ということで、医学への応用についても詳しく書かれています。
ヒトゲノムの中にウイルスに由来する配列があるということぐらいはなんとなく知ってましたが、それは真核細胞とシアノバクテリアの共生によってミトコンドリアが誕生したのと同様の共生の結果であり、これまでに幾度となく繰り返し生じているとは全然知りませんでした。しかも、内在化した（ゲノムに入り込んだ）ウイルスの中にはタンパク質を合成しているものや疾患・免疫に関与しているものもあるとか。もう訳分かりませんね。
かなり読み応えがありました。大げさですが、生物観を揺さぶられるような感じ。ただ半年ほど前に大方読んで放置していたので、今は熱が逃げてしまいました…。
破壊する創造者――ウイルスがヒトを進化させた (ハヤカワ・ノンフィクション文庫)
「成功した侵略種の生活史を解明する」
Sol D, Maspons J, Vall-Llosera M, Bartomeus I, García-Peña GE, Piñol J, Freckleton RP, 2012, Unraveling the life history of successful invaders, Science 337: 580-583.
ここ最近読んでいたinvasion successを決める因子についての面白くて読みやすい論文。環境汚染とは特に関係ありません。
鳥の侵入先での定着成功（0/1で表記）を、どのような形質が説明できるかGLMM等で調べたメタ解析論文です。全部で428種の2760導入事例について解析してます。これだけ膨大なデータがあるのが、やはり鳥とか昆虫の良いところですよね。こんなの甲殻類では絶対無理な気がします(知らんけど)。
個体群増加率がinvasion successを決定づけているかと思いきや、むしろ逆相関。個体群増加率の大きい種が定着成功しやすいしやすいのは、導入個体数が少ない（low propagule size) 時だけだったそうです。
結論としては、常にポンポン産む種よりシビアな環境では産卵を先延ばしにする種の方が一般的に定着成功しているとのことでした。
PLGS (phylogenetic generalizd least-squares) という手法があるのを知った。
前回の続き。前回は、外来種の方が高い汚染耐性を持つという報告を中心に見ましたが、今回はその逆の話。
Faria M, López MA, Díez S, Barata C, 2010, Are native naiads more tolerant to pollution than exotic freshwater bivalve species? An hypothesis tested using physiological responses of three species transplanted to mercury contaminated sites in the Ebro River (NE, Spain), Chemosphere 81:1218-1226.
外来種であるタイワンシジミ、ゼブラマッスルと在来種のP. littoralisをin situで水銀曝露させた論文です。在来種の致死率が一番高かった。
「タホ湖で紫外線とフルオランテンに曝露した在来魚・外来魚の耐性の違い」
Gevertz AK, Tucker AJ, Bowling AM, Williamson CE, Oris JT, 2012, Differential tolerance of native and nonnative fish exposed to ultraviolet radiation and fluoranthene in Lake Tahoe (California/Nevada), USA, Environ Toxicol Chem 31:1129-1135.
タホ湖でブルーギルとミノーを採取し、それぞれにフルオランテンへの曝露をおこなった論文。在来種であるミノーの方が耐性あり。
「在来・外来魚種の化学物質ストレスへの耐性：ライン川の事例」
Fedorenkova A, Vonk JA, Breure AM, Hendriks AJ, Leuven RSEW, 2013, Tolerance of native and non-native fish species to chemical stress: a case study for the River Rhine, Aquatic Invasions 8:231-241.
ライン川の在来魚36種と外来魚24種の毒性試験データを用いて全21物質のSSD (Species Sensitivity Distribution) を作成した論文。わずか数種の感受性だけを比較して結論を出す論文が多い中、良い方向性。傾向としては外来種の方がHC50が大きいけれど、どの物質でも統計的な有意差はなかったとのことです。
「侵入種のリスク管理：機能形質は侵入の戦略と成功にどれほど関与するのか？」
Weir SM, Salice CJ, 2011, Managing the risk of invasive species: How well do functional traits determine invasion strategy and success?, Integ Environ Assess Manag 7:299-300.
Learned Discourses。耐性だけじゃなくて、増殖速度も一緒に考えようという話。
